北京比较好皮肤科医院 http://m.39.net/news/a_6508755.html背景介绍
自然界使用64个三联密码子来编码20个天然氨基酸，并利用这20种氨基酸来合成蛋白质。而大多数氨基酸都由一个以上的同义密码子编码。人们普遍假设，删除基因组中有义密码子以及读取它们的tRNAs可能使细胞产生一些天然生物中没有的特性，比如新的病*抗性模式、合成非天然异质聚合物的能力。然而，到目前为止，这些假设还没有得到验证。尽管已有研究发现，删除大肠杆菌中的释放因子1（RF1），能够有效地终止终止密码子TAG的翻译，从而使细菌对一小部分噬菌体产生一定的抗性。然而,很多噬菌体在没有RF1的情况下也可以复制，这种通过删除RF1获得抗性的方法是不通用的。因为TAG终止密码子很少用于翻译的终止,甚至当病*基因在一个琥珀密码子处终止，而造成无法读取一个终止密码子，也不影响全长病*蛋白的合成。相比之下，在病*基因组中，有义密码子的丰度通常是琥珀密码子的至少10倍，并且分布在整个病*基因的范围内。因此，一个不读有义密码子的细胞将阻止细胞合成全长的病*蛋白，从而具有完全的病*抗性。目前，在细胞中编码含有非天然氨基酸的新单体蛋白的策略仅限于编码单一类型的单体（通常响应琥珀终止密码子TAG），这使得顺序编码的单体可能存在不兼容的问题，从而导致单体的低效结合。这些局限性使在细胞内合成完全由非天然单体组成的非天然异聚物序列难以实现。研究人员推测，如果将有义密码子重新分配到非天然氨基酸单体上，可以使不同的非天然氨基酸单体高效、有序地聚合，从而产生非天然异质聚合物。本文作者在前期研究的中，构建了一株大肠杆菌Syn61。Syn61的两个有义密码子（丝氨酸密码子TCG和TCA）和一个终止密码子（TAG）均被同义密码子取代。在本研究中，作者首先利用突变与进化，提高Syn61的生长速率。在此基础上，作者删除了TCG、TCA和TAG等密码子的反义密码子tRNAs和释放因子，获得菌株Syn61?3。随后的研究证明产生的菌株对混合病*具有完全的抗性。此外，作者同时也展示了编码的非天然氨基酸(ncAAs)对所有三个密码子的响应，以及菌株编码的完全非天然异质聚合物和环状聚合物在细胞中的合成。
研究结果
1、Syn61?3的创建
由于Syn61与出发菌株MDS42相比，其生长速率降低了1.6倍。为了提高菌株的生长速率，作者首先对Syn61进行两轮突变与筛选，获得生长速率提高1.5倍的Syn61（ev2）。在此基础上，作者删除了TCG、TCA和TAG等密码子的反义密码子tRNAs和释放因子，获得Syn61?3。由于Syn61?3的生长速率比Syn61(ev2)慢1.7倍，因此，作者继续对Syn61?3进行3轮突变与筛选后，获得Syn61?3（ev5）的倍增时间为38.72±1.02min（Fig.1）。与Syn61相比，Syn61?3（ev5）含有个额外的突变，其中包括个取代突变与62个缺失突变。但TCG、TCA和TAG等靶向密码子替换并无回复突变。
Fig.1.菌株进化与Syn61?3的创建。A,菌株进化示意图。B，Syn61和Syn61?3(ev5)创建过程时所有中间菌株的生长速率。
2、tRNA缺失使病*在Syn61?3中无法合成
通过改良的一步生长实验，作者接下来研究了删除编码tRNASerCGA、tRNASerUGA和RF1等基因的Syn61?3对噬菌体繁殖的影响（Fig.2A）。在Syn61(ev2)菌株中，T6噬菌体效价在升高至初始投入效价的两个数量级之前，已经开始下降（Fig.2C）。同样的，经T6噬菌体侵染后，Syn61（ev2）在nm波长处的光密度（OD）降低。然而，T6感染对Syn61?3的生长影响却很小（Fig.2D）。作者由此得出结论认为，当被T6噬菌体感染时，Syn61?3不会产生新的噬菌体颗粒，而T6噬菌体也不会裂解这些细胞。随后，作者进一步利用lambda,P1vir,T4,T6,以及T7等多种噬菌体混合物对不同细胞进行处理，结果发现，经噬菌体混合物处理后，菌株Syn61（ev2）与Syn61?RF1均裂解；而Syn61?3的则不受影响（Fig.2F，G）。
Fig.2.在Syn61?3中，噬菌体增殖与细胞裂解受阻。A.噬菌体感染Syn61?3示意图。B.T6噬菌体中TCG,TCA与TAG等密码子的数量及其位置示意图。C.T6噬菌体感染细胞培养液。D.T6噬菌体高效裂解Syn61突变体而非Syn61?3。E.每个噬菌体中每千碱基所指示密码子的数目。F.噬菌体侵染前后的细胞培养液变化情况。G.噬菌体侵染4小时后监测的细胞OD。
3、通过靶向密码子插入非天然氨基酸
以在Syn61?3（ev5）菌株中，通过表达基因Ub11XXX（编码的泛素-His标签蛋白在11位含有TCG，TCA，或者TAG）以及编码成对MmPylRS/MmtRNAPylYYY的同源正交基因，可使其反义密码子互补至Ub基因的11位密码子处（Fig.3A）。在不添加非天然氨基酸时，含有靶向密码子的Ub基因无法合成泛素。而未进行靶向密码子替换的对照菌株，则可以合成泛素。由此表明，在Syn61?3中，靶向密码子无法被内源的翻译机制读取，进而证明靶向密码子替换的正交性。而在MmPylRS/MmtRNAPylYYY中添加底物非天然氨基酸Bock（Nε-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysine）时，泛素的生成水平与野生型对照相当（Fig.3B）。随后的电离喷雾串联质谱（ESI-MS）证明，非天然氨基酸可以通过靶向密码子与MmPylRS/MmtRNAPylYYY的响应插入至泛素的11位密码子处（Fig.3C）。进一步的实验表明，作者成功证明密码子替换响应，插入2个，3个或者4个非天然氨基酸的Ub-His6均具有良好的蛋白表达（Fig.3D-I）。综上所述，这些结果表明Syn61?3衍生物的有义密码子TCG、TCA和终止密码子TAG可以有效地重新分配给非天然氨基酸。
Fig.3.在Syn61?3中将非天然氨基酸重新分配至两个有义密码子与终止密码子处。A.密码子重分配示意图。B.密码子重排使非天然氨基酸插入泛素的11位密码子。C.ESI-MS检测插入非天然氨基酸Bock的带有His标签的泛素。D.同B，在泛素的11位，65位密码子处插入非天然氨基酸。E.ESI-MS检测在11位，65位插入非天然氨基酸Bock的带有His标签的泛素。F.在泛素的11，14，65位密码子处插入非天然氨基酸。G.ESI-MS检测在11，14，65位插入非天然氨基酸Bock的带有His标签的泛素。H.在泛素的9，11，14，65位密码子处插入非天然氨基酸。I.ESI-MS检测在9，11，14，65位插入非天然氨基酸Bock的带有His标签的泛素。
4、编码不同的非天然氨基酸以响应不同的目标密码子
接下来，作者利用工程相互正交的氨基酰基tRNA合成酶（aaRS）/tRNA对，它们可以识别不同的非天然氨基酸并解码不同的密码子，从而将TCG、TCA和TAG密码子分配给Syn61?3（ev4）中不同的非天然氨基酸（Fig.4A）。为了响应TCG和TAG密码子，作者将两种不同的非天然氨基酸合并到泛素中（Fig.4B）,并证明了两个不同的非天然氨基酸插入泛素的四个位点，其中每个非天然氨基酸在蛋白质的两个不同位点插入（Fig.4B和4C）。为了响应TCG、TCA和TAG密码子，作者将三种不同的非天然氨基酸插入到泛素中，同样通过ESI-MS验证发现，可以在泛素中同时引入多个非天然氨基酸（Fig.4D和4E）。
Fig.4在Syn61?3细胞的TCG，TCA，以及TAG密码子处插入两个或者3个不同的非天然氨基酸。A.将TCG（蓝框）、TCA（金框）和TAG（绿框）密码子重新分配给Syn61?3中不同的非天然氨基酸。B.在一个基因中插入两个不同的非天然氨基酸以响应TCG和TAG密码子。C.ESI-MS检测纯化的Ub-（11CbzK,65ρ-I-Phe）（黑色）以及Ub-（11CbzK,14CbzK,57ρ-I-Phe,65ρ-I-Phe）（灰色）。D.将三种不同的非天然氨基酸插入到一个基因的TCG、TCA和TAG密码子中。E.ESI-MS检测纯化的Ub-（9ρ-I-Phe,11CbzK,14BocK）。
5、编码非天然氨基酸聚合物与环状聚合物
在上述研究的基础上，作者进一步探究了在单个多肽的不同位置同时引入不同组合的非天然氨基酸，从而合成丰富多样的氨基酸聚合物。对于由两个不同单体（A和B）组成的线性聚合物，有四个基本聚合类型（A+B→AB,B+A→BA,A+A→AA,B+B→BB），从这些类型可以组成任何序列（Fig.5A）。对于核糖体介导的聚合，这四个基本类型对应于每个单体作为氨基酰基位点（A位点）或肽基位点（P位点）底物，与同一类型单体的另一个副本或不同类型单体形成肽键（Fig.5A）。通过插入TCG-TCG（编码AA;在这个命名法中，单体A指定为TCG密码子），TAG-TAG（编码BB;单体B指定为TAG密码子）,TCG-TAG（编码AB）和TAG-TCG（编码BA）分别对应于超级折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）基因的3号密码子。作者验证了3对不同的AB组合体，其中包括A=BocK，B=ρ-I-Phe；A=CbzK，B=p-I-Phe；和A=AllocK，B=CbzK等（Fig.5B）。随后，作者将这些非天然氨基酸组合融合在绿色荧光蛋白的N端，合成了6个完全非天然的四聚体序列和每一对单体的六聚体序列（Fig.5C和5E)，并通过ESI-MS成功证明其聚合体的合成（Fig.5F）。此外，作者将非天然氨基酸对插入SUMO和GyrA-CBD（DNAgyrase亚基A肠素-几丁质结合域）之间，通过蛋白纯化与体外酶切反应，成功释放由AllocK和CbzK组成的四聚体和六聚体序列游离聚合物（Fig.5G到I）。最后，在编码的非天然氨基酸之间插入半胱氨酸，可使游离的六聚体序列自然环化成类似非核糖体肽的产物（Fig.5,G和J）。
Fig.5编码合成非天然氨基酸异质聚合物与环状聚合物。A.非天然氨基酸单体的聚合类型。B.异质聚合物的编码序列。C-E.由指定的非天然氨基酸组成的编码序列的聚合。F.ESI-MS检测纯化的含有非天然氨基酸六聚体的sfGFP-His6变异体。G.非天然氨基酸组成的线性与环状聚合物。H-J.线性和环状AllocK/CbzK异质聚合物的化学结构和ESI-MS谱图。
总结
本文在是在其前期建立的密码子压缩菌株Syn61的基础上，进一步删除了其反义密码子的编码基因，从而获得Syn61?3。随后，作者研究证明Syn61?3对多种噬菌体均具有病*抗性。此外，本研究通过对其有义密码子（TCA，TCG）以及终止密码子（TAG）的重新分配，在Syn61?3中成功合成多个非天然氨基酸聚合而成的异质线性或者环状化合物。本研究将使编码细胞合成具有潜在应用特性的非天然氨基酸异质聚合物成为可能。
团队介绍
JasonW.chin，医学研究理事会分子生物学实验室（MRC-LMB）项目负责人，剑桥大学化学与化学生物学教授。
研究领域：模式生物的遗传密码扩展；翻译重编程；翻译后修饰；蛋白标记与成像。
文献链接
DOI:10./science.abg撰稿人：刘志凤校稿人：毛国斌，马英新推送：李小颖
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