ThecanonicalRdDMpathwaymediatesthecontrolofseedgerminationtimingundersalinity
非典型RdDM途径在盐胁迫中介导控制种子萌发时间
发表时间年11月1日影响因子
PLANTJOURNALIF=5.
研究背景
植物对不利的环境信号作出反应，通过高度调控的机制调节各种过程，维持植物的体内平衡以维持生存。由于植物的固着性，它们对环境变化的反应、调整和适应，通过调节网络的串扰与它们的发育程序密切协调。萌发是植物生命周期中的一个关键过程，因此植物根据自身所处的环境演化出各种策略来控制萌发的时机。然而，涉及这些调整反应的机制在很大程度上是未知的。
研究材料
不同突变型拟南芥
研究技术
WGBS和RNA-seq
研究流程研究结果1、典型的RdDM途径是在盐胁迫下萌发的最佳途径
为了验证RdDM途径是植物应对盐胁迫所必要的，作者准备了不同的基因敲除材料：DCL3、RDR2和PolIV大亚基（NRPD1）以及PolV大亚基（NRPE1）。评估这些材料种子萌发概率发现在最佳生长状况下，所有的野生型和突变型的生长率相差无几，但是在高盐胁迫下（mMNaCl），突变体相对于野生型，其萌发率显著性降低，表明经典的RdDMR途径在高盐胁迫下种子萌发是必要的。
文献报道AGO4的缺失会导致DNA甲基化功能缺陷，作者制备了AGO4缺陷株来探索其在盐胁迫下的发育情况，发现虽然在正常生长条件下，缺陷株的萌发率只有轻微的变化，但是在盐胁迫下，相对于野生型ago4-2表现出低萌发率。为了排除该低萌发率是由于AGO4敲除而不是因为RdDMR途径的缺失导致，检测不同的突变型和基因敲除系在正常生长条件下以及盐胁迫下的萌发状况，发现ago4-6与ago4-2有相同的萌发率，而ago4-1、Ler基因型、ago4-4、Ws基因型与ago4-2在正常生长条件下有相似的萌发率，但是在盐胁迫下与ago4-2不同。WB检验这些不同的突变型和基因敲除系的AGO4蛋白表达。同时检测这些样本在不同的盐胁迫下（mMNaCl和mMNaCl）的种子萌发，这些缺失RdDMR通路突变株和点突变株ago4-2的种子萌发率下降，而相对于野生型，其他三个缺失ago4突变株种子萌发率增加，这样的结果证实这些表型的结果是来源于盐暴露。
为了进一步证实AGO4蛋白对表型的作用，将野生型和ago4-3缺失突变株进行遗传杂交。F2代置于正常生长条件和胁迫条件下统计其种子萌发率显示F2代野生型表型的恢复并且WB也能检测到AGO4蛋白的表达。另外，ago4-3缺失等位基因也在F2代中出现，并且WB检测不到AGO4蛋白表达，并且它在盐胁迫下表现出高萌发率，这些结果是与ago4缺失突变株一致，表明这些表型是由于AGO4缺失导致。而且这些F2代在正常生长条件下种子萌发率并无差别。
2、当AGO4缺失时，盐胁迫下AGO6在萌发过程中起主要作用
AGO4缺失株和ago4-2突变株的不同表现让作者考虑在植物生长发育过程中应答胁迫时，AGO4是否其额外的、独立于RdDM途径的作用，抑或在AGO4缺失时，在种子胚中低表达的AGO6可能起特殊的作用。为了区分这两种可能性，作者产生了ago4-6和ago6-2双突变株用于耐盐分析，结果显示相对于野生型，双突变株萌发率更低，这个结果与其他RdDM途径中核心元件缺失突变株的结果一致。这个结果表明AGO4并不是起额外的功能而是于AGO6起作用。AGO6可能的作用是在AGO4缺失时结合siRNAs来产生一个合成表型。在缺乏这两种AGO蛋白的情况下，测试其他RdDM突变体导致萌发不足的情况下，植物的应激反应被削弱。这个结果通过ago6单点突变得到证实，ago6单点突变后，测试其生长情况发现其与野生型表型一致，说明AGO6自己并不能单独发挥作用。
3、在种子萌发过程中和早期幼苗生长期AGO4蛋白丰度发生改变
鉴于上述证据表明RdDM对于盐胁迫下的最佳萌发是必需的，而AGO4在这一途径中发挥了关键作用，作者提出了其丰度是否在这一过程中被调节的问题。为此，作者WB检验在正常生长条件下和盐胁迫下AGO4蛋白在种子萌发和早期幼苗阶段的浓度变化情况。检验材料有6个阶段材料：干旱成层的种子、萌发18和36h的种子、下胚轴和子叶从种皮中显露出来的幼苗以及有两片莲座叶的幼苗。这些材料都是在最佳生长条件下萌发。WB结果表明AGO4蛋白在干种子分层后降低，随后逐渐增加直到分层36h后达到最高值。这个时间点之后，AGO4蛋白水平又逐渐降低直到测试的最后阶段。在盐胁迫条件下（mMNaCl），AGO4蛋白含量在分层阶段最高，随后一直降低，在两片莲座叶的幼苗中浓度最低，与正常生长条件下浓度一致。在盐胁迫中并未检测到AGO4转录水平的改变，说明AGO4蛋白水平丰度变化并不是在转录水平改变。这些数据表明，AGO4不仅存在于种子萌发和幼苗早期生长过程中，而且其水平会受到胁迫的调节，与典型的RdDM途径在这些发育阶段的功能相一致，并对不利的萌发环境做出反应。
4、AGO4应对盐胁迫有不同的定位
为了探索RdDM在种子萌发过程中发挥作用的幼苗区域，作者测定了AGO4在萌发和幼苗早期生长阶段的组织分布。构建转基因材料pAGO4::GFP-AGO4，通过GFP的荧光信号追踪蛋白定位情况。荧光信号追踪情况显示AGO4分布在细胞核，而且在种皮破裂后不久，AGO4的分布发生了变化，在子叶中保持了丰富度，但在胚根中含量较低且定位更分散。这种分布模式贯穿胚根突出、萌发后期和幼苗生长(吸胀后60h)。在后期，子叶中AGO4的积累更低，而在下胚轴和根尖中检测到信号。
对盐胁迫(mMNaCl)下的胚和幼苗进行分析时，子叶和胚根中也发现了GFP荧光；然而，在两个胚胎区域的维管组织中都明显地检测到强烈的信号。这种模式也出现在种皮破裂后，随后在后续阶段显著减少，在幼苗的根或子叶中几乎检测不到荧光信号。
在种子萌发后期和幼苗生长早期，在茎尖和根尖可以检测到一个尖锐信号，这与其他研究小组利用在最佳条件下生长的幼苗根系的转录组数据得出的结论一致。这一结果有力地说明了典型RdDM途径在种子萌发过程中对盐度的响应中起着特殊的作用。
5、RdDM在盐度条件下的萌发过程中以一种位点特异性的方式控制CHH甲基化
将不同的RdDM途径核心元件缺失突变株（ago4-3、ago4-2和nrpe1-11）以及野生型株系在最适生长条件或者盐胁迫下进行WGBS实验，结果显示所有的株系在不同生长条件下的甲基化水平如CG和CHG以及CHH含量都几乎没有变化。对获得的WGBS结果进行DMRs分析，结果发现相对于野生型，突变株系ago4-3、ago4-2和nrpe1-11分别呈现出、以及个CHH的DMRs；当这些株系置于盐胁迫下时，AGO4突变株的DMRs几乎增加一倍，而nrpe1的DMRs增加近20%，表明RdDM途径在盐胁迫时的萌发过程中发挥位点特异性作用。在分析过程中发现盐胁迫下这些样品的CG和CHG的DMRs也发生了变化。将鉴定的DMRs与基因组进行重叠分析显示大部分DMRs位于转座子内，小于20%位于蛋白编码区域、非编码区域或者假基因区域，表明RdDM的作用主要是控制TEs区域的甲基化。
6、AGO4-2等位基因产生低活性的AGO4蛋白
Ago4-2是AGO4的等位突变株，ago4-3是AGO4缺失突变株，对比这两个株系的DMRs发现ago4-3的DMRs数量是ago4-2的10倍以上，表明ago4-2产生了一个AGO4蛋白的弱异构体。将这两个突变体的DMRs进行重叠分析，并将结果分为三类：ago4-2特异性、ago4-3特异性以及ago4-2和ago4-3都有。结果表明，约60%的DMRs是在两个异构体中相同的。对比ago4-2特异性DMRs在ago4-3和nrpe1基因型中的含量发现这些DMRs呈现出比野生型更低的甲基化水平。分析ago4-3的特异性DMRs在ago4-2中的情况发现其在ago4-2中的甲基化水平与野生型中一致，而在nrpe1中的水平与ago4-3一致。因此，这些数据表明，与野生型相比，AGO4-2等位基因编码的AGO4蛋白对甲基化水平的影响更低，但不像在AGO4或PolV缺失突变体中那么低，与AGO4弱等位基因一致。
7、RdDM途径在萌发过程中应对盐胁迫时调控甲基化位点特异性
分析盐胁迫下野生型在CHH甲基化类型增加的DMRs，鉴定出盐胁迫下有个DMRs。用nrpe1甲基化特性作为RdDM参考，对比分析ago4-2和ago4-3突变株在最佳生长条件和盐胁迫下的甲基化特性，非胁迫和胁迫条件下甲基化增益的比较显示，野生型系的甲基化增益存在差异，但nrpe1、ago4-2和ago4-3的甲基化增益没有差异，AGO4-2与AGO4-3相比甲基化程度略有下降程度略有下降。这些结果表明，大多数位点特异性CHH甲基化的变化取决于AGO4和RdDM活性。
8、RdDM参与调控萌发时间
为了获得在盐胁迫下萌发过程中AGO4对基因表达的影响信息，作者使用Col-0、AGO4-3和AGO4-2在最佳和盐度条件下萌发的幼苗进行RNA-seq实验。我们首先
